1964, nachdem die Familie nach Houston umgezogen war, begann Roger Chaffees Astronautenausbildung. Dazu gehörte nicht nur weiteres Flugtraining, sondern auch Überlebenstraining für fehlerhafte Land- oder Wasserlandungen sowie das Studium der Mondoberfläche, da die dritte Astronautengruppe sich für die Mondlandung vorbereiten musste. Zu den Trainingseinheiten gehörte auch das EVA-Training (Weltraumausstieg) in einem großen Wasserbecken.
Als am 28. Februar 1966 die Astronauten Elliot See und Charles Bassett bei einem Flugzeugabsturz ums Leben kamen, fiel Roger Chaffee die Ehre zu, bei der Beisetzung mit anderen Kollegen den Sarg von See tragen zu dürfen.
Eine der ersten größeren Aufgaben Chaffees war es, bei der Mission Gemini 4 im Juni 1965 als Kommunikationsassistent zu agieren. Zusammen mit Gus Grissom flog er zudem eine Mission als Begleitflieger bei einer unbemannten Saturn 1B Mission, um deren Start zu fotografieren.
Kurz nach dem Flug von Gemini 8 mit Neil Armstrong und David Scott im März 1966 wurden von der NASA die Crewmitglieder für die erste bemannte Apollo-Mission bekannt gegeben. Als Kommandant wurde Gus Grissom benannt, zusammen mit Ed White als Chefpilot und Roger Chaffee als Pilot. Die Mission sollte im Frühjahr 1967 starten.
Während der nächsten Monate lernte die Crew in Downey, Kalifornien ihr Apollo-Raumschiff CSM-012, das im dortigen Werk zusammengebaut wurde, in- und auswendig kennen.
Da das Apollo-Raumschiff aber noch nicht den ausgereiften Status erreicht hatte wie die Gemini-Vorgängermodelle, wurde der Start verschoben und weitere Tests anberaumt.
Einer der wichtigsten Tests fand am 27. Januar 1967 in Cape Canaveral statt. Die gesamte Besatzung, Edward H. White, Roger B. Chaffee und Gus Grissom nahmen in der Kommandokapsel Platz, um einen Plugs-Out-Test durchzuführen. Während des Tests fing jedoch das Innere der Kapsel Feuer. Durch die Verwendung von reinem Sauerstoff mit leichtem Überdruck als Atmosphäre in der Kapsel breitete sich das Feuer innerhalb von Sekunden auf sämtliche brennbaren Materialien aus. Der Innendruck der Kapsel wurde durch die computergeregelte Sauerstoffzufuhr sofort erheblich erhöht. Alle drei Astronauten kamen dabei ums Leben, da die Luke weder von innen (zu hoher Innendruck durch das Feuer) noch von außen (keine Rettungs- mannschaften direkt an der Kapsel) schnell genug geöffnet werden konnte. Die Luke wurde daraufhin vollkommen neu konstruiert sowie mehr als tausend weitere Änderungen am Raumschiff und seiner Verarbeitung vorgenommen.
Chaffee ist in Sektion 3 neben Gus Grissom auf dem amerikanischen Nationalfriedhof Arlington bei Washington mit einem Staatsbegräbnis beigesetzt worden.